O Diagnóstico Genético Pré-implantacional (PGD) é uma nova forma de diagnóstico pré-natal, na qual os embriões são examinados para a presença de desordem genética, antes que sejam colocados no útero. É sabido que cerca de 5% de todos os neonatos têm uma anormalidade determinada total ou parcialmente genética.

As técnicas de PGD são de aplicação clínica recente e representam, hoje em dia, uma alternativa ao diagnóstico pré-natal.

Até agora, a única possibilidade de evitar o nascimento de descendentes comprometidos por doenças genéticas, anormalidades cromossômicas ou malformações congênitas era por meio do diagnóstico pré-natal amniocentese ou biópsia de vilo corial. Nestes casos, a gravidez já é evolutiva e esta por volta do 2º ou 3º mês. No caso do feto estar comprometido, existe a possibilidade, em vários países, entre eles Espanha e Inglaterra da interrupção voluntária da gravidez. Mas esta prática é ilegal em nosso país.

Casais que já tiverem uma criança com uma anormalidade hereditária ou casais nos quais existe uma doença hereditária, estão em risco aumentado de terem uma criança com alterações. Sem o PGD, as alternativas possíveis são:

(1) abdicar-se de ter seu próprio filho, recorrendo à adoção;

(2) correr o risco de ter uma criança com uma deficiência compatível com a vida e que, dependendo do acometimento, possa morrer jovem;

(3) caso conheça qual integrante do casal é o portador da anormalidade, opta-se por fazer uso de óvulo ou sêmen de um doador;

(4) diagnóstico pré-natal com a possibilidade de aborto seletivo em países onde a legislação o permita.

As opções de PGD são:

(1) Amniocentese – pode ser realizada entre 15 e 16 semanas de gravidez, sendo resultado conhecido entre 2 e 3 semanas;

(2) biópsia de vilo corial – realizável a partir da 10ª semana de gravidez, sendo o resultado conhecido em 1 semana;

(3) PGD – realizável cerca de 3 dias após a fertilização in-vitro e o resultado conhecido no mesmo dia. Sendo assim, o PGD é única alternativa que permite a transferência de embriões sadios que possibilita uma gravidez com nascimento de descendente normal. Para ser efetiva, essa técnica deve ser suficientemente específica e sensível para obter informação de um ou dois blastômeros (células do embrião) de cada embrião.

O PGD tem se tornado possível graças aos importantes desenvolvimentos das técnicas de pesquisa na genética molecular, como fluorescent in situ hybridization – FISH e polymerase chain reaction – PCR, tornou possível a composição genética da célula.

Indicações de Diagnóstico Genético Pré-Implantacional – quem se beneficia?

As indicações para o PGD coincidem parcialmente com aquelas para diagnóstico pré-natal. Os casais considerados para diagnóstico pré-natal podem ser divididos em 2 grupos:

(1) maior grupo- baixo risco, tais como mulheres acima de 36 anos;

(2) menor grupo – alto risco, como aqueles que tiveram criança com doença hereditária, ou com história familiar positiva. Esta pode ser decorrente de um gene defeituoso que seja transmitido de acordo com as Leis de Mendel. Desordens dominantes podem ocorrer em metade das crianças e recessivas em 25%. Uma desordem ligada ao X também é possível. Assim como estes defeitos genéticos, existem também desordens cromossômicas com alto risco de serem repetidas.

O PGD não é completamente isento de risco á paciente. Ele envolve, todavia, riscos não-conhecidos para as crianças nascidas, é um método mais dispendioso, podendo reduzir a taxa de gravidez.

BIÓPSIA

Durante o processo e maturação do oócito, duas divisões reducionais ocorrem (meiose 1 e 2). Primeira divisão meiótica produz o oócito secundário e o primeiro corpúsculo polar. Completa-se a segunda divisão meiótica, após a penetração do espermatozoide. Cerca de dois dias a fertilização, ocorrem as primeiras clivagens, que originam os pré-embriões, contendo vários blastômeros. Cinco dias após a fertilização, blastocisto já se formou.

O material necessário para o diagnóstico pode ser removido de estágios diferentes. Basicamente, existem duas fases distintas: (1) antes da fertilização (biópsia de corpúsculo polar); (2) após a fertilização (blastômeros ou células trofoblásticas). Cada método tem suas vantagens e desvantagens.

BIÓPSIA DO PRIMEIRO CORPÚSCULO POLAR

O oócito é fixado por meio de uma “holding” e uma abertura é feita na zona pelúcida no outro lado do oócito usando uma micropipeta com solução de Tyrode ou mesmo com o laser. A abertura é feita justamente na largura pela qual seja possível a aspiração do corpúsculo polar por uma micropipeta um pouco mais calibrosa. Com relação ao genótipo, o corpúsculo polar é um “blue print” do oócito. Como principais desvantagens apresenta:

1)exame só oferece a possibilidade de diagnóstico de desordens genéticas maternas;

2) somente uma célula é examinada;

3) possibilidade de se não detectar a anormalidade genética devido ao “crossing over” que ocorre na meiose 1.

BIÓPSIA NO ESTÁGIO DE 4 A 8 CÉLULAS

Tem sido mostrado que é possível a retirada de 1 ou 2 células no estágio de 4 a 8 células, sem se ter influência negativa sobre o desenvolvimento embrionário. As células são independentes e totipotentes, nessa fase.

Após a fixação do pré-embrião com “holding“, uma micropipeta é usada para se fazer uma abertura com a solução de Tyrode ou laser na zona pelúcida (este orifício é maior do que o produzida na biópsia de corpúsculo polar). Usando uma micropipeta mais calibrosa, cerca de 2/3 do tamanho do blastômero, uma ou duas células são removidas do pré-embrião.

BIÓPSIA NO ESTÁGIO DE BLASTOCISTO

É uma forma de biópsia tardia no estágio de pré-implantação.

Neste estágio, nos podemos diferenciar dois tipos celulares os embrioblastos e os trofoblastos, dos quais a placenta e outros anexos serão formados, mais tarde.

Após a fixação do blastocisto com a “holding“, uma abertura grande é feita na zona pelúcida de um blastocisto mais desenvolvido, usando uma agulha cortante de vidro (mais de ¼ da circunferência). Após 18 a 24 horas alguns dos blastocistos eliminarão, por extravasamento, algumas células que serão as analisadas.

Neste estágio de desenvolvimento, existem cerca de 100 células divididas entre embrioblasto e trofoblasto. Acredita-se que 10 células ser removidas sem afetar o futuro desenvolvimento. Pela remoção das células do trofoblasto, das quais a placenta se originará, o embrião não é afetado, fornecendo, provavelmente, melhores chances de desenvolvimento. Inexplicavelmente o maior problema para a biópsia tardia é que as chances de implantação são bem menores.

FISH

O avanço mais importante para a identificação do sexo em embriões humanos foi a introdução de técnicas de FISH, que utiliza sondas de DNA marcadas com haptenos fluorescentes frente a sequências específicas dos cromossomos sexuais, que se desejam identificar; mais tarde, sua aplicação se estendeu a outros autossomos responsáveis pelas principais aneuploidias. Com o FISH, fragmentos específicos de DNA podem ser modificados quimicamente ou enzimaticamente e, desta forma, uma sonda de DNA é formada.

Quando o FISH foi introduzido, peças específicas de DNA forma marcadas radiativamente, mas o refinamento do método tem feito possível o uso de certas moléculas ou substâncias fluorescentes que marquem o DNA. Fragmentos específicos são complementares ao alvejado no DNA. Um híbrido é formado, sendo possível identificar o fragmento alvo.

PCR

É uma outra maneira de detectar sequências do DNA da célula. É um método de grande importância para o PGD. Pela modificação de sequências específicas do DNA de cromossomos sexuais, a determinação sexual tem sido usada com sucesso para diagnosticar várias desordens ligadas ao X (incluindo retardamento mental ligado ao X, síndrome de Lesch-Nyhan, distrofia muscular de Duchenne). Outras anormalidades não ligadas ao sexo podem ser também determinadas pelo PCR, como fibrose cística, hemofilia A e deficiência de alfa-antitripsina.

O PCR consiste na amplificação de uma sequência de DNA, que permite obter um elevado número de cópias dessa sequência, possibilitando sua mediante eletroforese. Inconveniente: pode produzir erros diagnósticos por falha de amplificação do DNA ou por contaminação com DNA exógeno (2% a 6%).

Sua maior aplicação no PGD é a identificação de mutações nas enfermidades relacionadas com um único gene, quando se conhece sua seqüência, como na mutação DF-508 da fibrose cística, a beta-talassemia, a anemia falciforme, a doença hemolítica e a doença de Tay-Sachs.

OBS.: laser no laboratório de FIV- sua utilidade é a produção de um orifício da zona pelúcida de oócitos e embriões mediante a degradação por fototermolise de sua matriz proteica. Por suas características, o laser se tem tornado uma peça valiosa nas técnicas de biópsia embrionária: segurança, rapidez, precisão. Além do mais, permite controlar a amplitude do orifício, sem a necessidade de micromanipulação adicional nem uso de substancias químicas (ácido de Tyrode). A realização do orifício depende da energia do pulso, do tempo que a onda de pulso, da capacidade de difusão salina, onde se realiza o procedimento, o tamanho da superfície de incidência do raio, do plano focal e do tipo de laser.